PCR Как избежать ошибок?

Диагностическим мероприятиям в процессе вынашивания ребенка уделяется большое внимание. Лабораторные данные позволяют выявить состав крови, идентифицировать патогенного агента и соотнести риски рождения нездорового малыша. ПЦР диагностика один из достоверных методов исследования биологической жидкости и влагалищного отделяемого (слизь, соскоб, биоптат).

Материалом для осуществления ПЦР-диагностики могут служить

  • Эпителиальные соскобы со слизистых оболочек. Обычно используются для диагностики заболеваний, передающихся половым путем (ЗППП), таких как гонорея, хламидиоз, микоплазмоз, уреаплазмоз, трихомониаз, гарднереллез, герпетическая и другие инфекции, поражающие слизистые оболочки.
  • Моча. Моча может использоваться при инфекционном поражении мочеполового тракта у мужчин и мочевыделительных органов у женщин (у мужчин использование в качестве материала мочи заменяет эпителиальный соскоб).
  • Мокрота. Мокрота используется для диагностики туберкулеза и реже для диагностики респираторных форм хламидиоза и микоплазмоза. Мокроту в количестве 15-20 мл собирают в стерильный (одноразовый) флакон.
  • Кровь, плазма, сыворотка. Используются для ПЦР анализа вирусов гепатитов B, C, D, G, герпеса, ЦМВ, ВИЧ, исследования генов человека.
  • Биологические жидкости. Сок простаты, плевральная, спинномозговая, околоплодная, суставная жидкость, бронхоальвеолярный лаваж, слюна забираются по показаниям.
  • Биоптаты. Чаще всего используют биоптаты желудка и двенадцатиперстной кишки для выявления хеликобактерной инфекции.

Анализ пцр относительно молодой, ему около 30-ти лет. Данная методика исследования прошла все этапы эволюции и сегодня является одной из самых информативных. Смысл заключается в многократном увеличении ДНК искусственным образом. Осуществляется повторение той части, которая имеется лишь у определенной разновидности патогенного возбудителя.

Время воздействия составляет три минуты. Достаточно около тридцати таких этапов, чтобы вышло нужное число молекул для четкого выявления агента способом электрофореза.

Кроме этого медики сращивают части ДНК, выполняют различные мутации, что позволяет применять анализ пцр диагностику не только с целью выявления инфекционных и генетических нарушений, но и для подтверждения или опровержения родственных связей, клонирования и прочее.

Проведение пцр анализа осуществляется в специальных медицинских учреждениях с применением специализированной техники.

ПЦР-исследование

Полимеразная цепная реакция — основной метод, который Минздрав России рекомендует для выявления инфекции или подтверждения ее отсутствия. Принцип работы метода прост: если в мазке из ротоглотки пациента нет генетического материала вируса, реакция не начнется.

Процедура взятия мазка кажется несложной, но от нее напрямую зависит результат теста. Брать биоматериал должен только квалифицированный медицинский персонал, знающий некоторые тонкости. Например, зондом нельзя собирать слюну и касаться щек, языка, десен или губ.

По этой причине не стоит доверять наборам для самовзятия биоматериала. Цена ошибки высока: люди, получившие ложноотрицательные результаты, будут спокойно выходить в общественные места и заражать окружающих.

Со стороны пациента потребуется подготовка к ПЦР. За три часа до исследования нельзя есть, пить, курить, полоскать рот и жевать жвачку.

За счет механизма работы ПЦР позволяет обнаружить вирус на самой ранней стадии, не дожидаясь конца инкубационного периода и появления первых симптомов. Еще одно преимущество — скорость. Учитывая прочие факторы, такие как логистика, современные лаборатории могут озвучить результат уже через день.

Типы ПЦР анализа

Полимеразная цепная реакция, сокращенно ПЦР.

Представляет собой метод, используемый для экспоненциальной амплификации определенной последовательности ДНК-мишени.

Позволяющей изолировать, секвенировать или клонировать одну РНК среди многих.

ПЦР была разработана более 30 лет назад, американским биохимиком Кэри Муллисом. 

Читайте также:  Болит правое яичко: причины у мужчин и разновидности болевых ощущений

Полимеразная реакция имеет широкое использование, применяется не только как анализ на ИППП.

Применение ПЦР практикуется в следующих направлениях: генотипирование:

  • клонирование
  • обнаружение мутаций
  • секвенирование
  • криминалистика
  • тестирование на отцовство

Как правило, ПЦР представляет собой трехступенчатую реакцию.

Образец, содержащий разбавленную концентрацию матричной ДНК, смешивают с термостабильной ДНК-полимеразой.

Такой как Taq-полимераза, праймер, дезоксинуклеотидтрифосфаты (dNTP) и магний. 

На первой стадии ПЦР образец нагревают до 95-98 градусов.

На втором этапе температуру снижают до приблизительно 55-65 градусов.

На третьей стадии температуру обычно повышают до 72 градусов.

Эта последовательность денатурации, отжига, и расширения повторяется для множества циклов.

Что и приводит к экспоненциальному усилению матричной ДНК.

ПЦР достаточно сложный, но информативный метод исследования.

Зачастую применяется в диагностике патологий вирусной и инфекционной этиологии.

Анализ позволят практически со 100% точностью выявить и определить разновидность патогенного микроорганизма.

В последнее время, полимеразная реакция приобрела популярность в ранней диагностике туберкулеза.

Позволяет выявить возбудителя с 98% точностью на доклинической стадии. 

Преимущества диагностики туберкулеза при помощи ПЦР:

  • Максимально высокая точность обнаружения присутствия в организме Mycobacterium tuberculosis, за счет использования специального фермента, предназначенного для возбудителя туберкулеза. 
  • Высокая чувствительность анализа, как следствие, исследование способно обнаружить присутствие даже одной бактерии. 
  • Быстрота получения результатов диагностики. Тестирование проводится достаточно быстро, уже спустя 3-5 часов можно получить готовые результаты. 

Mycobacterium tuberculosis является внутриклеточным микобактериальным патогеном.

Представляет собой одно из самых распространенных и наиболее серьезных инфекционных заболеваний в мире.

Типы ПЦР анализа

Считается, что более 2 миллиардов людей имеют скрытую инфекцию M. Tuberculosis.

Около 8 миллионов — активную форму туберкулеза.

Кроме того, пациенты с ВИЧ и нарушением работы иммунитета на фоне заболевания чаще подвержены дополнительному инфицированию бактерией M. tuberculosis.

В их случае патология протекает сложнее, с многочисленными осложнениями.

ПЦР при подозрении на туберкулез является наиболее востребованным и точным анализом.

Способен выявить заболевание на самых ранних сроках, а также прибегнуть к своевременному, эффективному лечению.

Качественный ПЦР на гепатит С

В большинстве случаев, качественный ПЦР назначается при выявлении в организме пациента антител к гепатиту С.

Полимеразная реакция при подозрении на гепатит С проводится по следующему принципу.

Первое тестирование — на четвертую неделю после обнаружения антител.

Второе — на двенадцатую неделю, третье — на двадцать четвертую.

Далее анализ назначается на постоянной основе, один раз каждые 12 месяцев. 

Проведение полимеразной реакции на гепатит Б, А, Ц позволяет получить максимально точные результаты за счет высокой чувствительности теста от 10 до 500 МЕ/мл.

Это дает возможность определять наиболее низкие показатели присутствия в организме вируса и контролировать его дальнейшее развитие. 

Расшифровка результатов проводится лечащим врачом.

Положительный анализ говорить о наличии патогенного микроорганизма.

Отрицательный — чаще об отсутствии, но на 100% не исключает НСV. 

Взятие анализа на проведение ПЦР НСV проводится в утреннее время, биологическим материалом является венозная кровь. 

Пцр количественный на гепатит с

Количественная полимеразная реакция назначается пациентам, уже имеющим диагноз «гепатит С».

Задача анализа выявить вирусную нагрузку на организм.

Определить количественное присутствие патогена, а также понять, насколько проводимая терапия эффективна.

Расшифровать результаты диагностического исследования поможет лечащей врач-гепатолог.

Зачем беременным проходить диагностику

ПЦР при беременности является одним из обязательных видов исследований. Анализу подлежит кровь, а при необходимости, слизистый вагинальный секрет.

У беременных анализ проводится дважды – при постановке на учет по беременности и родам, и в середине заключительного триместра.

Преимущества анализа заключаются в возможности определить наличие или отсутствие вирусов, или иных микроорганизмов, вызывающих тяжелые нарушения в гестации и развитии плода.

Бактерии могут вызывать различные осложнения и негативно сказывать на развитии крохи.

Отсутствие лечения может привести к фатальным последствиям или даже явиться причиной преждевременных родов или самопроизвольного выкидыша.

Какие можно определить заболевания?

Посредством рассматриваемого анализа можно выявить следующие патологии:

агенты, среди которых возбудители:

  • ВИЧ.
  • Гепатита А, В, С, D, G.
  • Инфекционного мононуклеоза.
  • Клещевого энцефалита.
  • Герпеса I и II типа.
  • Цитомегалии.
  • Папилломавирусной инфекции.

2. Некоторые виды бактериальных инфекций:

  • Туберкулез.
  • Хеликобактер пилори.
  • Гарднереллез
  • Листериоз.
  • Кампилобактериоз.
  • Сифилис.
  • Гонорея.
Какие можно определить заболевания?

3. Внутриклеточные паразиты:

  • Хламидии.
  • Уреаплазмы.
  • Микоплазмы.

4. Инфекции, спровоцированные грибками:

  • Трихомониаз.
  • Кандидоз.

На сегодняшний день к указанному тестированию весьма часто прибегают криминалисты, когда нужно установить, кому принадлежит биологический материал, взятый с места преступления.

При помощи полимеразной цепной реакции можно также установить отцовство.

Расшифровка анализа

Процесс интерпретации представленного исследования отличается своей простотой.

Результаты пцр анализа можно получить уже на следующее утро, и вот что они могут означать:

  1. Отрицательный результат показывает, что в диагностируемом материале отсутствует искомый инфекционный возбудитель.
  2. Пцр положительный обозначает, что в организме человека присутствует ДНК или РНК возбудителя.

Чтобы понять, что означает анализ пцр, необходимо произвести количественное определение микроорганизмов. Это целесообразно выполнять при болезнях, вызванных условно-патогенными микроорганизмами. Причина в том, что такие возбудители показывают свое отрицательное влияние только при избыточном количестве.

Расшифровка анализа

Когда вы поняли, что значит метод пцр, можно сделать вывод: такая диагностика лучше всех позволяет получить информацию о присутствии определенного типа инфекции.

Такой способ позволяет обнаруживать разнообразные по своей природе возбудители в различном биологическом материале.

Кроме этого, время анализа пцр составляет 5–10 минут, а полученная расшифровка содержит достаточно информации о том, какой тип инфекции и в каком количестве присутствует в организме.

Мазок ПЦР количественный на хламидии

На хламидии чаще проводят тест качественный, а не количественный.

Потому что этот микроорганизм является патогенным.

Одного только факта его обнаружения достаточно, чтобы начать лечение.

Причем, количество копий ДНК не играет существенной роли в определении схемы терапии и дозировок препаратов.

Тем не менее, количественные тесты иногда проводят.

Мазок ПЦР количественный на хламидии

Они дают врачу возможность оценить прогноз заболевания.

Понять, насколько высока вероятность осложнений.

А также спрогнозировать ответ на лечение.

При большой концентрации хламидий в урогенитальном тракте доктор может увеличить курс терапии.

Оценивая данный показатель в динамике, он может понять, работают ли те антибактериальные препараты, которые он назначил.

Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 амплификация нуклеиновых кислот: Метод, позволяющий увеличить многократно число копий фрагмента нуклеиновых кислот (ДНК/(кДНК)/РНК).

3.2 ГСО: Стандартный образец утвержденного типа [1].

3.3 ДНК: Дезоксирибонуклеиновая кислота.

3.4 Идентификация с использованием метода ПЦР: Выявление нуклеотидных последовательностей, строго специфичных для целевого таксона организма, с использованием методов амплификации нуклеиновых кислот.

3.5 ПЦР: Полимеразная цепная реакция — метод молекулярной биологии, позволяющий увеличить малые концентрации определенных фрагментов ДНК и РНК в биологическом материале.

3.6 ПЦР-набор: Набор (тест-система), состоящий из праймеров и реагентов для проведения ПЦР.

3.7 Тест-ПЦР-набор: ГСО специфических (видоспецифичных) ДНК или РНК фрагментов, имеющих 100%-ную идентичность с тестируемым участком генома идентифицируемого объекта, с реагентами для проведения и контроля ПЦР.

3.8 чувствительность: Минимальное количество биологического материала представителя целевого таксона (отдельных видов микроорганизмов, растений, линий или штаммов генетически модифицированных организмов), необходимое для его идентификации.

3.9 специфичность: Способность определить наличие в образце только того объекта, для выявления которого был разработан ПЦР-набор.

положительный контрольный образец: Индикатор работы амплификационной смеси и маркер длины специфических ПЦР-фрагментов нуклеиновых кислот, соответствующих определяемому организму.

отрицательный контрольный образец: Образец для оценки возможной контаминации реактивов для выделения ДНК, включающий в качестве матрицы ДНК организмов, близкородственных определяемому данным ПЦР-набором.

положительный контроль ПЦР: Образец для контроля качества амплификационных реактивов, включающий в качестве матрицы ДНК организмов с секвенированным геномом и специфические праймеры к участку геномной ДНК этого организма.

отрицательный контроль ПЦР: Образец для контроля контаминации амплификационных реактивов, включающий деионизированную воду.

ВЫСОКИЕ ЗНАЧЕНИЯ CQ ДЕЛАЮТ РЕЗУЛЬТАТЫ ТЕСТА ЕЩЕ БОЛЕЕ БЕССМЫСЛЕННЫМИ

Другая важная проблема заключается в том, что многие тесты ПЦР имеют значение «количественной оценки цикла» (Cq) более 35 циклов, а некоторые, включая «тест Drosten PCR», даже имеют Cq 45.

Читайте также:  Как берется мазок из уретры у мужчин — Фертильность

Значение Cq указывает, сколько циклов репликации ДНК требуется для обнаружения реального сигнала от биологических образцов.

«Значения Cq выше 40 являются подозрительными из-за предполагаемой низкой эффективности и как правило, не должны сообщаться», — говорится в рекомендациях MIQE .

MIQE означает «Минимум информации для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени», набор руководящих принципов, которые описывают минимальную информацию, необходимую для оценки публикаций по ПЦР в реальном времени, также называемой количественной ПЦР или qPCR.

Сам изобретатель Кэри Муллис согласился, когда заявил :

Если вам нужно пройти более 40 циклов для амплификации гена с единственной копией, с вашей ПЦР что-то серьезно не так ».

Рекомендации MIQE были разработаны под эгидой Стивена А. Бустина, профессора молекулярной медицины, всемирно известного эксперта по количественной ПЦР и автора книги AZ по количественной ПЦР, которую назвали «библией количественной ПЦР

ПРИЛОЖЕНИЕ

Кривая амплификацииКривая амплификации показывает зависимость флуоресценции репортерного красителя от номера цикла. Реакции различаются по времени, когда возможно обнаружить продукты амплификации. Чем больше изначальное количество ДНК-матриц в исследуемом образце, тем раньше возникнет достаточная для детекции флуоресценция.

Базовая линияВо время начальных циклов реакции наблюдаются фоновые флуоресцентные сигналы. В соответствие с этим фоном необходимо настроить значение базовой линии.

Дельта RnЗначение ΔRn представляет собой разницу значений Rn и базовой линии.

Референтный красительКраситель, который создает внутреннюю референтную флуоресценцию, по отношению к которой можно нормализировать репортерную флуоресценцию. Нормализация необходима для того, чтобы скорректировать флуктуации, связанные с различиями концентраций компонентов реакционной смеси, объема и особенностей образца.

Эффективность ПЦРСледующая формула описываю прохождение ПЦР:Cn=Ci*(1+E)n , гдеCi – начальное количество ДНК-матрицы,Cn – количество ампликонов на цикле n,n – количество циклов,E – эффективность данной эффективность максимальная (=1), тогда формула приобретет вид Cn=Ci*2n, при этом количество продуктов реакции (ампликонов) будет увеличиваться в 2 раза с каждым циклом. Если эффективность ниже, то каждый цикл ампликоны будут синтезироваться в меньшем количестве, что отобразиться на кривой амплификации. Оптимальная эффективность – от 90 до 110%.

Репортерный красительРепортерный краситель связан с 5’-концом зонда TaqMan®. При гибридизации зонда с ДНК-матрицей, этот краситель дает флуоресцентный сигнал, сигнализирующий об успешной гибридизации. Если используется краситель SYBR® Green , то сигнал последует при интеркалляции красителя в двухцепочечеую ДНК, что свидетельствует об успешной амплификации. Специфичность связывания с целевой последовательностью ДНК необходимо проверить по кривой плавления продуктов реакции, либо на гель-электрофорезе.

RnЗначение Rn представляет собой отношение интенсивности флуоресценции репортерного красителя к интенсивности флуоресценции референтного красителя.

Пороговое значение (пороговая линия, порог чувствительности)Это значение ΔRn для CT в данном виде анализа. Порог чувствительности настраивается таким образом, чтобы он был выше базовой линии, но при этом кривая амплификации должна пересекать его в самом начале экспоненциальной фазы.

Пороговый цикл (CT)Цикл, во время которого кривая амплификации пересекает пороговое значение.