Молекулярно-генетические методы исследования

Использование методов молекулярной диагностики помогает обнаружить заболевание на ранней стадии, а значит, более эффективно бороться с ним.

Вам будет интересно

28179 0 Антитела против коронавируса должны оставаться в крови на годы 23905 0 Члены семей пациентов с COVID-19 имеют Т-клеточный иммунитет 18871 0 Антитела против SARS-CoV-2 обнаружили почти у всех пациентов с положительным ПЦР-тестом 17829 0 Интерфероны увеличивают выработку белка ACE2 — рецептора для коронавируса 17147 0 Бессимптомные пациенты с COVID-19 выделяют столько же вирусной РНК, сколько больные 16428 0 Серологический тест на SARS-CoV-2: поиск и анализ антител к новому коронавирусу 12337 0 У здоровых людей найдены T-лимфоциты, реагирующие на SARS-CoV-2 8400 0 Коронавирус SARS-CoV-2 проникает в центральную нервную систему через обонятельный эпителий 7649 0 Тяжелая пневмония при COVID-19 может быть связана с вдыханием секрета ротоглотки 7068 0 Уханьский коронавирус: геномов все больше, промежуточный хозяин пока не установлен

Часть Какую информацию генетики могут сообщить человеку уже сейчас, а какую — не могут

Еще несколько десятилетий назад ученые научились проверять у человека наличие определенных (описанных в научной литературе) мутаций, приводящих к наследственным болезням, — таким как гемофилия. Традиционно для этого используются различные варианты технологии ПЦР (полимеразной цепной реакции), позволяющей «размножить» интересующий фрагмент ДНК в пробирке и, получив достаточное количество биологического материала, провести молекулярно-биологические исследования (фрагментный анализ, секвенирование и др.) В последнее десятилетие все бóльшую популярность набирает технология ДНК-микрочипов, предназначенных для одновременной проверки наличия большого количества описанных ранее мутаций, положение которых в геноме хорошо известно (рис. 1). Подробнее с методами молекулярной биологии можно ознакомиться в статье «Важнейшие методы молекулярной биологии и генной инженерии» [2].

Рисунок 1. Сравнение ведущих методов молекулярно-генетической диагностики. Все эти методы нацелены на то, чтобы узнать информацию, содержащуюся в ДНК человека. Подробнее о них рассказывается в статье [2].

Результаты такого анализа можно достаточно уверенно трактовать в терминах медицинской генетики. Известна связь исследуемых мутаций с болезнями и вероятность, с которой та или иная комбинация мутаций приведет к болезни. В помощь тем людям, у которых обнаружены опасные мутации, разработаны методы пренатальной диагностики и преимплантационной генетической диагностики (ПГД). В отдельных случаях создано специфическое лечение.

Новейшие методы генетического анализа, основанные на полногеномном секвенировании, расширяют диагностическое поле с набора отдельных мутаций (пусть и большого) до всей последовательности ДНК: здесь уже можно найти мутации, ранее в литературе не описанные и «невидимые» для метода микрочипов по причине отсутствия их точных «координат». Однако с трактовкой таких «новых» мутаций есть большие сложности. Отчасти они связаны со сложностью биоинформатической задачи обработки огромных массивов данных без потери значимой информации. Но самое большое препятствие состоит в том, что, не обладая информацией о здоровье людей, имеющих ту же самую мутацию, уверенные прогнозы насчет конкретного больного сделать нельзя.

Читайте также:  eMedicine Imaging of Dendy-Walker Malformation

Рисунок 2. Технология ДНК-микрочипов. ДНК пациента гибридизуется с коротким фрагментом «референсной» ДНК, закрепленной на поверхности ДНК-микрочипа. После гибридизации происходит удлинение референсной цепи на один нуклеотид в том самом месте, где находится искомая мутация. Нуклеотиды, участвующие в достройке ДНК, помечены различными флуоресцентными метками, и по регистрации флуоресценции в лазерном луче можно определить, какой именно нуклеотид включился в ДНК и, следовательно, какую мутацию содержит ДНК пациента.

Кроме мутаций, среди генетических вариаций выделяют еще полиморфизм — присутствие в популяции нескольких вариантов гена. В медицинской генетике принято различать мутации, как клинически значимые варианты, а полиморфизмами называть такие варианты, у которых клиническое значение слабое или непонятное. Полиморфизмы в разных генах встречаются очень часто и в некоторой степени объясняют, почему, например, люди по-разному реагируют на лекарства или усваивают продукты питания (переваривают молоко, например). Есть такие полиморфизмы, анализ которых сообщает информацию скорее не для лечения, а для интереса — почему отличается вкусовая чувствительность, как гены влияют на характер или даже спортивные склонности. Практикуется также исследование аллелей в особых генетических локусах (аллель — более широкое понятие, чем полиморфизм, — обозначает любые варианты одного и того же гена), которое позволяет определить происхождение человека по отцовской и материнской линии.

А еще можно проводить тестирование на предрасположенность к многофакторным заболеваниям — таким как рак, диабет, ишемическая болезнь сердца. В каждом случае известно множество задействованных генов, в большинстве которых определены и существенные мутации, и полиморфизмы с неясным значением. Однако помимо этого на риск развития таких болезней огромное влияние оказывают негенетические факторы, так что однозначного прогноза по генетическим тестам сделать просто нельзя.

Вообще, нужно четко понимать: чем дальше от медицины (с ее давно и тщательно собираемыми клиническими данными), и чем больше генов участвует в регуляции процесса, тем труднее по результатам генетического тестирования сказать пациенту что-то определенное. И тут, когда мы вручаем человеку листок с результатами, он недоуменно смотрит на него, а потом поднимает глаза и говорит: «Ну и что?» К сожалению, ответить на этот вопрос чаще всего нечего.

Всегда ли ошибаются тесты

Следует понимать, что сомнительный тест далеко не всегда бывает ошибочным. Вполне возможно, что результаты повторных обследований будут идентичными. Но в любом случае медики, сотрудники лабораторий пытаются разобраться, почему первые данные вызвали сомнения. Одна из причин — малоизученность коронавирусной инфекции. Структура ее возбудителя необычна, объясняет легкость проникновения в дыхательные пути, ускоренную репликацию, быстрое распространение по дыхательной системе.

Это интересно: У коронавирусов на поверхности есть шипы, с помощью которых они «обманывают» клеточные рецепторы и проникают внутрь, начиная размножаться.

Пока еще окончательно не изучен механизм развития инфекции. Это означает, что тесты будут постепенно совершенствоваться, а их чувствительность — повышаться. Самостоятельно определить информативность лабораторной диагностики невозможно. Это прерогатива врача. Он сопоставляет полученные данные с клинической картиной, эффективностью проводимого лечения, наличием инфицированных родственников.

Первый этап

Инкубационный период коронавирусной инфекции — время с момента внедрения патогенов в организм до появления выраженных симптомов. Длится он у взрослого человека с хорошим состоянием здоровья — от одной до двух недель. Его продолжительность составляет от 1 до 3 дней при наличии хронических заболеваний, а также у зараженных людей пожилого и старческого возраста. В медицинской литературе описаны случаи позднего появления симптомов на фоне приема иммуномодуляторов и противовирусных лекарств.

Читайте также:  Менопауза

Тест ИФА на коронавирус вызывает сомнения, если он выполнен во время инкубационного периода

Всегда ли ошибаются тесты

Пока признаков опасной патологии нет, врачи не рекомендуют выполнять тестирование, так как его результат может быть сомнительным. С коронавирусами борются интерфероны, часто с большим успехом. Если ими были уничтожены патогены, то антитела иммунной системой не вырабатывались. Так что, результат тестирования будет сомнительным.

Второй этап

Может ли быть ложноположительный тест на коронавирус

Может ли быть сомнительным тест на второй стадии развития инфекции? Это реально при обследовании методом и иммуноферментного анализа, и ПЦР. Первые симптомы проявились, поэтому человек самостоятельно или по назначению врача принимает противовирусные средства, оставляя иммунную систему без работы. Антитела начнут вырабатываться только на заключительном этапе второй стадии.

Третий этап

Почему даже при выраженных признаках болезни ошибаются тесты? На третьей стадии коронавирусов в организме немного. Они покинули его по большей части, но оставили после себя мощный инфекционно-воспалительный процесс в бронхолегочной системе. Медики используют выражение «цитокиновый шторм». Вырабатывается огромное количество медиаторов воспаления, что приводит к повреждению собственных тканей организма. Это может исказить результаты лабораторного тестирования.

Диагностика инфекций молекулярно-генетическими методами

Своеобразной революцией в молекулярной диагностике стала разработка технологии полимеразной цепной реакции. Принцип ПЦР метода заключается в многократном удвоение ДНК/РНК, осуществляемом в лаборатории с помощью ферментов. Таким образом, образуется достаточное количество исследуемого материала для визуального анализа.

При проведении ПЦР — сущность метода позволяет копировать лишь участки ДНК/РНК, соответствующие заранее заданным параметрам, становится доступным не только высокоточная диагностика наследственных болезней.

Диагностика инфекций методом ПЦР позволяет выявить на ранней стадии:

  • ВИЧ-инфекцию и гепатиты А, В, С, G;
  • вирус герпеса, 1 и 2 типов;
  • мононуклеоз и цитомегаловирусную инфекцию;
  • туберкулез;
  • онкогенные вирусы (папиллома);
  • листериоз, кандидоз, боррелиоз;
  • инфекции, передающиеся половым путем (хламидиоз, трихомониаз, микоплазмоз, уреаплазмоз);
  • клещевой энцефалит; хеликобактерную инфекцию.

Для диагностики хламидиоза широко применяется также метод лигазной цепной реакции (ЛЦР). В этом случае используется способность ДНК-лигаз восстанавливать фосфодиэфирные связи в одноцепочечных разрывах двухцепочечных молекул ДНК.

Метод лигазной цепной реакции широко используется при анализе урогенитальных, эндоцервикальных образцов. Особенно эффективен этот метод для выявления хламидиоза в моче у женщин. Надежность диагностики очень высокая, до 99%.

Генетический анализ у новорожденного

Генетический анализ на предрасположенность к болезням проводится в рамках неонатального скрининга. Это обязательная процедура, утвержденная ВОЗ с целью ранней диагностики новорожденных. Как правило, она проводится в первые 10 дней после рождения ребенка: на 3-4 день – у доношенных и 7 день – у недоношенных.

Читайте также:  Методы осмотра у гинеколога в разные периоды жизни женщины

Забор крови проводят в родильном отделении, или в домашних условиях, если маму с ребенком уже выписали. Для этого медсестра делает легкий прокол на пятке младенца и наносит несколько капель выступившей крови на специальный бланк. Запечатанный образец отправляют в лабораторию, где в течение 10-14 дней будет готов результат.

Несмотря на возможность диагностирования более 50 генетических заболеваний, скрининг проводится на предмет выявления пяти из них:

Генетический анализ у новорожденного
  • фенилкетонурия;
  • муковисцидоз;
  • андрогенитальный синдром;
  • гипотиреоз;
  • галактоземия.

Данные заболевания при ранней диагностике поддаются лечению, поэтому их внесли в обязательный перечень. При желании родителей, спектр исследований можно расширить.

Прямые методы

Прямыми методами ДНК-диагностики пользуются в случаях, когда ген-виновник наследственного заболевания известен, а также известны и типы его мутаций. Например, целесообразны прямые методы при целом ряде заболеваний. Это хорея Гентингтона (расширение CTG-повторов), фенилкетонурия (R408W), муковисцидоз (delF508, мажорная мутация) и тому подобные. Главным преимуществом прямого метода является стопроцентная точность диагностики, а также нет необходимости делать ДНК-анализ остальной семьи. Если мутация в соответствующем гене обнаружена, это позволяет совершенно точно утвердить диагноз наследственности, определить генотип для всей остальной отягощённой семьи.

Другим достоинством прямой диагностики считается выявление гетерозиготного носительства нехороших мутаций у родственников и родителей умершего от болезни. Это особенно актуально для заболеваний аутосомно-рецессивных. Недостатки у прямых методов тоже имеются. Чтобы их применить, нужно точно знать локализацию патологического гена, экзон-интронную его структуру и спектр его мутаций. Далеко не все моногенные болезни сегодня получили подобную информацию. Информативность прямых методов не может считаться полной, поскольку один и тот же ген может иметь большое количество патологических мутаций, что и обусловливает развитие наследственных болезней.

Нормальные значения результатов

В норме результаты ПЦР-анализа на флору у женщин будут следующими:

Показатель Количество, шт.; КОЕ/мл
Клетки плоского эпителия Max 15, уменьшение показателя свидетельствует о воспалении, увеличение – о гормональном сбое
Лейкоциты Max 10, на шейке матки – max 30
Палочки Дедерлейна 107-109
Слизь умеренно
Грибы рода Кандида
Степень чистоты 1-2

В заключение к исследованию у мужчин указывается уровень клеток эпителия, лейкоцитов, кокков и выявленных чужеродных микроорганизмов. В норме лейкоцитов должно быть 0-5, эпителиальных клеток – 5-10, умеренное количество слизи. Трихомонад и гонококков присутствовать не должно.

При повышении концентрации лейкоцитов и эпителиальных клеток, наличии эритроцитов и значительного количества слизи можно говорить о развитии воспаления. Признаками патологий являются обнаруженные бактерии, дрожжевые грибки, трихомонады, гонококки, внутриклеточные паразиты.

Примечание: Окончательный диагноз на основании результатов анализов ставит только врач.